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本试剂盒适用于喉咽棉拭子、泄殖腔棉拭子、各种组织样品、尿囊液、细胞培养液等样本中的诺如病毒G1/G2亚型的研究检测。

• 试剂盒应在-20℃以下保存和运输。
  
• 本试剂盒仅用于科研实验检测，操作人员必须经过专业培训，使用前请仔细阅读说明书全文。
  
• 不要使用过期组分或者不同批次组分混合使用。
  
• 使用时尽量避免反复冻融，冻融不应超过5次，否则建议分装后使用。
  
• 样本采集和处理过程应遵循生物安全管理要求。
  
• 荧光PCR实验严格分区操作，各区应有专用手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循单方向工作原则，各工作区相对隔离。
  
• 测试样本时，应做好生物安全防护。
  
• 试验完毕后，使用过的试剂、样本应进行无害化处理。

• 拭子样本：采集咽拭子、泄殖腔拭子样本。在装有拭子的离心管中加入500μL PBS或生理盐水，剧烈振荡30sec。尽量吸出液体移到离心管中6000rpm离心20sec，取上清备用。
  
• 体液样本：采集抗凝血，转移至1.5mL灭菌离心管；使用静止法或离心法制备血清后吸取上层血清，转移至1.5mL灭菌离心管；取唾液、鼻液、支气管分泌物置于灭菌的收集管中。
  
• 组织样本：称取组织约0.1g于研磨器或组织匀浆器中研磨（最好置于冰上或加入液氮），再加1mL生理盐水研磨至无块状物，然后将样品转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液于1.5mL灭菌离心管中。

可采购我公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒(货号：SYA790)或柱式RNA提取试剂盒(货号：SYA781)并按照相应说明书进行操作。

• 阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸（无需再提取），直接取5μL加入到反应体系中即可。
  
• 由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

• 从试剂盒中取出诺如病毒G1/G2亚型qRT-PCR反应液、诺如病毒G1/G2亚型酶混合物，完全复融并振荡混匀后，瞬时离心。
  
• 设所需要的PCR反应管管数为N（N＝样本数+2），配制加样见下表，瞬时离心后尽快扩增检测。
  

  成分	用量
  诺如病毒G1/G2亚型qRT-PCR反应液	14μL×N
  诺如病毒G1/G2亚型酶混合物	1μL×N
  待测核酸样品/阳性对照/阴性对照	5μL×N

  • 建议将所需反应液和酶混合物按反应总数量+1预混合后分装到PCR管中，每管分装15μL。
• 按下表进行qRT-PCR反应程序。
  

  过程	反应参数	循环数
  反转录	45℃ 10min	1
  预变性	95℃ 10min	1
  PCR扩增	95℃ 15sec	40
  	60℃ 45sec

  • 在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置FAM和VIC（若仪器无VIC通道，可选择HEX或JOE通道）。其中FAM基团检测G1亚型，VIC基团检测G2亚型。
    
  • 使用ABI品牌的仪器时，需将淬灭基团改为NONE，请勿选择ROX参比荧光。

• 试验成立判定：
  
  • 阴性对照（NTC）：不应产生任何的扩增曲线；
    
  • 阳性对照（PTC）：产生扩增曲线。
    
  • 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
• 结果判定：
  

  	Ct值≤35	无Ct值3	5≤Ct值≤40且有明显扩增曲线
  FAM-G1	阳性+	阴性-	可以样本
  VIC-G2	阳性+	阴性-	可以样本

  对于可疑样本，重新提取核酸，再次进行对应的PCR检测。如果重复结果Ct值≤40且出现对数扩增曲线判为样本阳性；否则判为样本阴性。